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载体构建

基因过表达载体构建
基因过表达指细胞利用自身元件把储存在表达质粒DNA中的遗传信息转录、翻译成具有生物活性的蛋白质分子的过程,基因过表达是目前研究基因功能最常用的手段。

百恩维生物可以提供以PCR为基础的各类载体构建,如细菌表达载体、酵母表达载体、动物表达载体,报告基因载体等。
●多顺反子表达(multi-cistron expression): 通过2A、IRES、多启动子、融合表达等手段,在一个质粒里实现同时表达两个或者两个以上基因。
●上百种工具载体可选,满足不同研究需要:包括各种原核、真核表达载体、以及各种病毒载体。
●多种报告基因示踪: 绿色荧光蛋白:GFP、eGFP、emGFP、ZsGreen1、hrGFP,红色荧光蛋白:mcherry、DsRed-Express2、tdTomato,此外还有YFP等。
●可选择各种启动子: CMV、mCMV、EF1a、PGK、SV40、UBC,CAG以及各种组织特异性启动子。
●多种亲和标签融合:His、flag、GST、c-myc、HA、MBP等等。


shRNA表达载体构建
shRNA(short hairpin RNA, shRNA)是一段小发卡或短发卡RNA序列,一般长19~23bp,常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞,载体中的U6或H1启动子确保shRNA的表达;shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA,然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上(RNA induce
-d silencing complex,RISC),该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。通过载体可以将shRNA整合到细胞基因组中,从而使细胞长期稳定表达shRNA。
百恩维生物可提供多种shRNA表达载体,如慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、以及普通的真核表达载体等;同时也有多种荧光报告基因可供选择,如GFP、eGFP、tdTomato、YEP等;另外还有药筛基因可供选择:Puromycin、Neomycin等,用于后期构建稳定表达shRNA的细胞株。
百恩维生物可以构建常规的1条shRNA干扰表达载体,也可在同一个表达载体中构建多条shRNA(百恩维生物的专利技术),干扰效果更强。
您只需告诉我们您需要干扰的目的基因,我们就会为您设计相应高质量的shRNA序列信息,其干扰效率保证大于70%。
技术服务内容如下:
1、接受客户目标基因信息;
2、分析目标基因,并设计高质量的shRNA序列;
3、PCR退火形成shRNA双链;
4、将shRNA双链克隆至含有U6或H1启动子的表达载体上;
5、测序以确保插入序列的正确性;
6、向客户提交测序结果与实验方法报告单。


microRNA表达载体构建
MicroRNA(miRNA)是一类真核生物内源性的小分子单链RNA,通常长为18~25nt,能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对结合,引起靶序列降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。构建miRNA表达载体,实现microRNAs在细胞中稳定表达,能够弥补瞬时转染持续时间短的不足,miRNA的表达方式通常包括pri-miRNA,pre-miRNA与成熟microRNAs形式。
百恩维生物有多种表达载体,如真核表达载体、各种病毒表达载体等;可选择各种荧光报告基因,如GFP、eGFP、tdTomato、YEP等。
百恩维生物提供以下两种miRNA表达方式:(1)pri-miRNA(初级转入产物)的表达形式;(2)pre-miRNA(miRNA前体)的表达形式。
客户只需提供miRNA的具体信息及指定过表达载体类型(如慢病毒载体),我们完成序列合成,质粒构建。
技术流程如下:
1、miRNAs序列分析;
2、PCR引物设计及合成;
3、PCR扩增pri-miRNA序列或者单链互补引物退火形成pre-miRNA序列;
4、将片段克隆至含有CMV强启动子的载体上;
5、测序以确保插入序列正确性;
6、向客户提交测序结果与实验方法报告单。


Tet诱导表达载体构建技术服务
目前,已经研究开发出了多种Tet调控表达载体系统,主要分为Tet-on系统和Tet-off系统。在进行基因功能研究中,多用Tet-on系统,而Tet-off系统基本弃用。
百恩维生物能为您提供Tet-on诱导表达系统的载体构建服务,并且有多种表达载体供您选择:
1.常规的真核表达的两质粒Tet-on系统。
2.百恩维生物自主开发的病毒(慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)单质粒Tet-on系统,构建好的质粒可直接用于真核表达,也可包装相应的病毒后使用,感染效率更高,目标基因诱导表达水平更强。
3.病毒单质粒Tet-on系统不仅可以表达目标基因,也可用于表达ShRNA。
4.百恩维生物自主开发的病毒单质粒Tet-on系统,含有GFP标记基因、药筛标记(Neomycin、Puromycin),可用于构建稳转细胞株。
   

★ Tet诱导表达原理
四环素(Tet)诱导调控表达系统的基本原理是由诱导药物(如Tet)改变调控蛋白质的构象,从而控制目标蛋白质的表达。最初的Tet诱导调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵基因(Tet operator, TetO)DNA序列有特异的亲和能力,当细胞内无Tet存在时,TetR会与TetO结合,从而阻断下游的抗性基因表达。当有Tet存在时,药物使TetR的构象发生改变,导致TetR与TetO分离,从而引起抗性基因的抑制解除,抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。
利用TetR和TetO特异结合的特性,目前开发改造了多种类型的Tet调控表达载体系统,但根据其表达特点可以归为两大类:抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。

★Tet-off调控系统
最早的Tet-off基因调控表达系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)启动Tet转录活化因子(tetracycline transcrip-tional activator, tTA),tTA由TetR与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白质C端的一段转录激活区融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)、最小CMV启动子(minimal CMV promoter, Pmin
CMV)及目的基因组成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游;TRE为7次重复的TetO序列。PminCMV缺失增强子,因此在tTA未结合到TRE时,目的基因不表达;相反,当tTA结合到TRE时,VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。当细胞内无Tet或其衍生物强力霉素(doxcycline, Dox)的存在时,tTA可与TRE结合,打开基因表达;而当Tet或Dox存在时,它们可使tTA中的TetR改变构象,则tTA将从TRE上脱落下来,使TRE中的PminCMV处于非激活状态,从而使基因表达处于关闭状态。
★Tet-on调控系统
Tet-on调控系统与Tet-off调控系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet转录活化因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator, rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverse TetR, rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR由TetR中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的。rTetR的表型与TetR相反,在无Dox时,其不能结合TRE,导致基因表达关闭;而在有Dox存在时,其会结合在TRE上,导致基因表达开放。
          
★Tet诱导调控表达系统的优点
1.具有低本底与高诱导倍数的特点,无诱导时目的基因表达水平低,诱导时其表达水平增高,最高诱导倍数可达10,000倍。
2.诱导所需的时间短,Dox为脂溶性,容易渗透细胞和组织,在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达。
3.该诱导系统是一种可逆系统,当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭,之后仍可通过加入诱导剂重新开启。
4.诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox),安全。Tet作为一种抗生素已被人们应用了很长时间,已被广泛作为抗生素使用,是对人体较为安全的一种药物。


★Tet诱导调控表达系统的应用
Tet系统被广泛应用于动物体内和体外(细胞水平)基因功能、蛋白质功能、以及mRNA功能的研究,也用于体外基因治疗的研究。
比如该系统已成功的用于胰岛细胞、肺组织、脑组织以及帕金森病、软骨病等基因治疗实验研究中,目前该系统也用于诱导多能干细胞(induced luripotent stem cell, iPS cell)技术中的重编程因子表达的调控。

 

1970-01-01

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